Trägerlose Einführung von Fluor-18 in Urokinase unter Erhaltung der biologischen Aktivität

Müller-Platz, C. M.

Book/Report

FZJ-2018-01872

Trägerlose Einführung von Fluor-18 in Urokinase unter Erhaltung der biologischen Aktivität

Müller-Platz, C. M. (Corresponding author)FZJ*

1982
Kernforschungsanlage Jülich, Verlag Jülich

Jülich : Kernforschungsanlage Jülich, Verlag, Berichte der Kernforschungsanlage Jülich 1775, 79 p. (1982)

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/17682

Report No.: Juel-1775

Abstract: Urokinase aktiviert Plasminogen und leitet so die Fibrinolyse ein. Sie ist sehr substratspezifisch und kann deshalb als Diagnostikum zur Thrombenlokalisation nach Markierung mit geeigneten radioaktiven Isotopen eingesetzt werden. Bisherige Ergebnisse waren jedoch unbefriedigend, da entweder das Markierungsisotop (Art der Strahlung, Stabilität der chemischen Bindung) und/oder die Markierungsmethode im Hinblick auf die Erhaltung der biologischen Aktivität ungeeignet war. Zur regionalen Thrombenlokalisation mit Hilfe der Positronenemissionstomographie ist vor allem Fluor-18 (T = 110 min) geeignet. Das Radioisotop kann aber nicht direkt in Urokinase eingebaut werden, da das Enzym nur in wässriger Lösung stabil ist, F$^{-}_{aq}$ aber in protischen Lösungen unreaktiv ist. Als Zwischenstufe zur Markierung von Urokinase wurde deshalb $^{18}$F-Fluoressigsäure ausgewählt. $^{18}$F-Fluoressigsäure konnte mit einer radiochemischen Ausbeute von bis zu 60 % durch nukleophilen Br-für-$^{18}$F Austausch in Bromessigsäureäthylester trägerlos synthetisiert werden. Die Reaktion wurde in einer Acetamidschmelzedurchgeführt. Nach Verseifung der Ester wurde die freie Säure mit Hilfe der HPLC von der Bromessigsäure und Verunreinigungen abgetrennt. Die Synthesezeit für die Präparation der trägerlosen $^{18}$F-Fluoressigsäure betrug 80 min, und die erreicht spezifische Aktivität war $\geq$ 37 TBq/mMol. $^{18}$F-Fluoressigsäure kann durch wasserlösliches [N-Äthyl-N'-(dimethylamino)propyl]-carbodiimid (WCS) gut aktiviert werden und als aktivierte Säure an die freien Aminogruppen der Urokinasekovalent gebunden werden. Die Säureaktivierung ist bei pH 4 bis 7 bei geringen Mengen an Säure und hohem Überschuß an WSC nur von der WSC-Konzentration abhängig und läuft ohne Nebenreaktionen quantitativ ab. Die Reaktion ist protonenkatalysiert, führt aber über die dissoziierte Form der Säure. Dadurch istdieser Schritt hauptsächlich vom pK$_{a}$-Wert der eingesetzten Säure abhängig und bei pK$_{a}$ = 2,66 von $^{18}$F-Fluoressigsäure wird eine ausreichende Markierungsausbeute erhalten. Markierungsversuche mit 1-[1-$^{14}$C]-Essigsäure mit pK$_{a}$ = 4,78 blieben dagegen erfolglos. Die Amidbildung war allein von der Konzentration der in der Lösung vorliegenden aktivierten $^{18}$F-Fluoressigsäure abhängig. Die Bindung der $^{18}$F-Fluoressigsäure ohne Trägerzusatz an Urokinase verlief mit 30 %-iger radiochemischer Ausbeute und führte zu einer spezifischen Aktivität von $\geq$ 22,2 TBq/mMol. Die Enzymaktivität wurde durch einen direkten photometrischen Test mit einem Peptidsubstrat (S2444) bestimmt. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der markierten Urokinasemoleküle im 1000-fachen Überschuß nicht markierter Moleküle wurde mit Hilfe einer Affinitätschromatographie mit Agmatin als Bindungspartner für Urokinase durchgeführt. Verschiedene Markierungsansätze wurden so auf die biologische Aktivität des markierten Enzyms untersucht. Dabei konnte in einigen Fällen gezeigt werden, daß schon bei einem geringen Verlust der Gesamtenzymaktivität alle markierten Urokinasemoleküle biologisch inaktiv waren. Die Inaktivierung des Gesamtansatzes betrifft die markierten Moleküle bevorzugt. Durch Veränderung der Reaktionsbedingungen (pH-Wert und Reaktionszeit) konnte jedoch eine Methode erarbeitet werden, bei deren Anwendung nicht nur die Enzymaktivität des Ansatzes vollständig erhalten blieb, sondern auch die der radiochemischen Ausbeute entsprechende Radioaktivität mit der bindungsfähigen Urokinase eluiert wurde. Vergleichbare Experimente zur trägerlosen Markierung mit $^{131}$I und $^{77}$Br durch elektrophile Substitution nach Oxidation mit Chloramin-T waren weniger erfolgreich und führten bei $^{77}$Br zu einem vollständigen Verlust der Bindungsfähigkeit bei 30 % erhaltenerEnzymaktivität. Die trägerlose Markierung von Urokinase, ausgehend von $^{18}$F gelang mit einer radiochemischen Ausbeute über alles von 8 % bei einer Synthesezeit von 110 min. Das Verfahren erlaubt es, ausreichende Aktivitätsmengen für die in-vivo Anwendung der Thrombuslokalisation bei Patienten zu produzieren. Das Verfahren, Proteine über $^{18}$F-Fluoracetat prinzipiell ohne Verlust der biologischen Aktivität zu markieren, sollte auch auf andere Proteine übertragbar sein.

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